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助诊断,促应答?肿瘤里的菌还能干吗?

编者按:

长久以来,人们一直认为肿瘤是无菌的环境,但是研究证实,肿瘤内存在微生物,这些微生物不仅对癌症的发展进程有至关重要的作用,还可能影响机体对治疗的反应。

今天,我们共同关注肿瘤微生物组的研究进展。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。

① 支原体惹得祸

2008 年,麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究所的博士后、癌症生物学家 Ravid Straussman 参与了一项合作研究――筛选出正常细胞,研究其对癌细胞对各种抗癌疗法反应的影响。

该项目发现了数百个基质细胞在体外以某种方式赋予相邻癌细胞耐药性的案例。其中一个案例引起了 Straussman 的注意:人胰腺癌和结直肠癌细胞系在与真皮成纤维细胞共培养时可以逃避化疗药物吉西他滨的“攻击”。

Straussman 解释说,在实验室中,癌细胞“在治疗的过程中继续增殖,这对我来说非常有趣,因为我不理解……基质细胞是如何保护癌细胞免受化疗的影响的。”

接下来的一年半里,他一直在试图弄清楚到底发生了什么。他排除了几个假设,包括基质细胞分泌保护性蛋白质或外泌体。Straussman 说:“我们有很多想法,但结果都不是对的。”

接着,他发现所使用的成纤维细胞中含有一种名为支原体的细菌,支原体是组织和细胞培养过程中的一种常见污染物。“当时我很震惊,”他回忆说,“我大概花了一年半的时间来追踪。”Straussman 觉得自己几乎毁了这整个项目,但后来他开始好奇了。

在随后的实验中,Straussman 证实,正是这些细菌将癌细胞从化疗中解救出来:当他用抗生素处理成纤维细胞时,它们不再保护癌细胞免受吉西他滨的侵害;当他用支原体感染其它基质细胞时,它赋予了基质细胞保护癌细胞免受药物侵害的能力。“所以我们意识到,并不是基质细胞从化疗中拯救了癌细胞,而是支原体拯救了癌细胞。”

问题是,这种细菌是否存在于天然的肿瘤中呢?与当时普遍认为的“肿瘤是无菌的”观点相反,Straussman 想知道癌细胞是否真的可以承载微生物生命,就像人体内隐藏着微生物组的诸多组织一样。吉西他滨当时是胰腺癌的一线治疗药物,至今也仍被广泛使用。“如果胰腺癌中有细菌,而细菌能发挥如此美妙的作用,这可能真的很有趣。”

② 肿瘤无菌or有菌

2013 年,Straussman 接受了以色列魏茨曼科学研究所提供的一个教职,并决定从事这一领域的研究。Straussman 与魏茨曼研究所、博德研究所的研究人员一起对 113 例人类胰腺癌样本进行了测序,并对细菌 DNA 进行了鉴定。

果然,研究人员在 76%的样本中发现了细菌基因特征。Straussman 说:“我们没有在胰腺癌样本中发现支原体,但我们发现了许多其它细菌。而且我们发现,这些从肿瘤细胞中分离出来的细菌,在体外也可以拯救癌细胞免受化疗的伤害。”

下一个问题是这是如何做到的。进一步的研究表明,细菌生活在癌细胞靠近核膜的位置。在那里,它们会在吉西他滨到达细菌基因组之前吸收它,并从药物中切割出一个胺基,使其失活。

Straussman 指出,这些发现出人意料,以至于该小组的一名技术人员花了一年多的时间才确信它们的真实性。后来,这名技术人员申请了一些与肿瘤中存在细菌有关的专利。2017 年 9 月,该团队在Science杂志上发表了他们的研究成果,提供了肠道外肿瘤中存在细菌的首批证据。

虽然当时的想法通常是肿瘤是无菌的,但是长期以来一直有“肿瘤中存在微生物”的报道,但问题是在大多数情况下,这些研究都无法排除污染的可能性。然而,在 Straussman 和他的团队公布这些发现后不到五年的时间里,多个团队确切地证明了肿瘤中存在特定菌群。

加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的微生物组研究人员 Rob Knight 说,已经有数十篇的论文提供了大量证据表明肿瘤确实有自己的微生物组。

事实上,今年 1 月,瑞士洛桑联邦理工学院的 Douglas Hanahan 将“多态性微生物组(polymophic microbiomes)”添加到了著名的癌症特征列表中,并指出“虽然肠道微生物组一直是这一新领域的先驱,但多种组织和器官都与微生物组相关”。

研究人员正在迅速将这些发现转化为可应用于临床的工具。肿瘤中微生物的存在可能为新的癌症诊断方法提供概念基础,Knight 最近与合作伙伴共同创立了 Micronoma 公司,旨在开发利用血液中细菌核酸特征来检测癌症的新方法。

研究人员也在探索利用肿瘤微生物组来治疗癌症的可能性,Straussman 说,他现在正在建立一家名为 Baccine 的新公司来实现这一目标。他还为 Biomica 公司提供咨询服务,Biomica 公司专注于基于肠道微生物组的一系列疾病治疗,包括癌症。

但是,尽管一些科学家已经在寻找潜在的临床应用,但是肿瘤微生物组生物学的许多基本问题仍然没有解决。最紧迫的问题涉及微生物是否以及如何影响癌症的发展和进展,还有患者对治疗的反应。

“有很多基础生物学尚未被发现。”Micronoma 公司的联合创始人兼执行官 Greg Sepich-Poore 说道,他是一名刚从 Knight 团队毕业的博士。

MD Anderson 创新微生物组和转化研究项目(PRIME TR)的科研主任、病毒学家 Nadim Ajami 表示:“描述这些细菌和病毒的存在,这只是第一步。我们真正想要的是了解它们在癌症发病、疾病进展、治疗反应中的作用,着眼于如何利用这些信息来预防癌症的发展或提高疗效。”

③ 肿瘤:一个大熔炉

“肿瘤是无菌的”这一观点被推翻在很大程度上要归功于二代测序的发展和癌症基因组数据集的整理。正如 MD Anderson 的医学博士 Jennifer Wargo 所解释的那样,“当进行全基因组测序时,不仅会得到人类的序列,还会得到微生物的序列……而不会过滤掉微生物,所以我们实际上可以非常清楚地知道那里有什么微生物以及它们有什么功能。”

Wargo 是 PRIME TR 项目的发起人,她补充说:“这很复杂,因为任何时候收集这些组织,都不一定只是为了观察微生物,因此收集它们的方式可能会让情况变得复杂。可能会有很多污染物。”

这是一个特别的挑战,因为在肿瘤中发现的微生物群落相对较小,例如,细菌的数量远不如肠道中丰富。这种被称为低生物量的样品对污染非常敏感,而根据 Straussman 的说法,污染是不可能完全避免的。他说:“几年前,我们费了很大的劲,尝试把所有的东西都彻底清理干净……但我们发现做不到这一点。总会有一些细菌 DNA 污染。”

因此,当他和 Wargo 以及他们的同事决定调查 1526 份样本(来自七种不同的肿瘤类型,包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌和脑癌),以解决细菌在肿瘤中是否常见的问题时,他们需要控制这种必然性。

于是,他们在每个步骤中都加入阴性对照,包括 DNA 提取、PCR 以及测序过程,他们甚至取了少量保存肿瘤组织的石蜡块,以控制首次采集样本时引入的污染。Straussman 说:“所以说到底,通过这些操作,我们能知道背景噪音是怎样的,以及真正来自肿瘤中 DNA 序列是怎样的。”

根据阴性对照剔除了 90%以上的序列后,研究小组能够识别每种肿瘤类型所具有的不同的细菌特征,其中乳腺癌表现出特别丰富和多样化的微生物组。

然后,为了确定这些细菌是否真的生活在肿瘤内,研究小组培养了肿瘤切片,并用荧光染色的丙氨酸异构体对其进行处理(细菌可以将丙氨酸结合到它们的细胞壁中)。Straussman 说,当他们在显微镜下看到细菌发光时,这“很好地证明了这些肿瘤中存在活细菌”。

Ajami 说,这项于 2020 年 5 月发表在Science杂志上的研究结果,“朝着正确的方向又迈进了一步,他们不仅依靠生物信息学工具来确定这些细菌信号的存在;还将其与成像相结合。因此,他们能够识别肿瘤内的细菌,在某些情况下,还能够识别这些肿瘤中存在的胞内细菌。”Ajami 为一些从事微生物组研究和开发的生物技术公司提供咨询服务。

此外,Straussman 的团队从来自 5 名接受手术的女性的乳腺肿瘤样本中,培养出了数百个菌落,主要是来自变形菌、厚壁菌和放线菌的成员。

Straussman 并不是唯一一个研究肿瘤微生物组的人。越来越多的研究提出了新的数据和方法,以确定肿瘤中是否存在微生物。

瑞典卡罗琳斯卡研究所的临床免疫学家和肿瘤微生物组研究人员 Margaret S?llberg Chen 通过与医生合作,从癌变前的胰腺囊肿中采集细菌样本,之前他们在手术室中发现了来自囊肿的细菌 DNA。

她解释道:“当他们取出胰腺时,可以采集样本,并将其直接接种到培养基中。”通过这种方式,该团队成功地培养出肠球菌、肠杆菌和克雷伯菌等细菌,相关结果于 2021 年 11 月发表在Gut Microbes杂志上。

S?llberg Chen 说,因为有些微生物在暴露于氧气后会死亡,所以在采集肿瘤样本和保存其中的微生物群落时,时间至关重要。“通过这种非常快速的培养方法,我们成功地培养了一些胰腺微生物。”

虽然需要进行更多的研究来确定微生物在癌症中的作用,但是这些探究肿瘤微生物组的研究人员一致认为,所有证据都表明,肿瘤确实不是无菌的,并且通常含有微生物。Straussman 说:“基本论点是,肿瘤中确实存在活细菌。”

④ 微生物诊断

其实在 2020 年 Straussman 于Science杂志上发表该论文之前,Knight 团队在Nature杂志上已经发表过类似的研究。与 Straussman 的团队一样,Knight 和他的同事调查了一系列的肿瘤,并从分析结果中舍弃了高达 93%的序列数据,以排除污染。

与 Straussman 的发现一样,Knight 的研究结果表明微生物是肿瘤的共同特征,微生物的构成因肿瘤类型而异。但是 UCSD 团队采取了一种完全不同的方法,他们选择清理和分析现有的序列数据,而不是重新对样本进行测序。

在 2012 年圣诞节后的第二天,Sepich-Poore 的祖母被诊断出患有胰腺癌,当时他还是大学一年级新生。隔年 1 月底,他的祖母因病去世。而医生们却无法解释为什么癌症没有更早被发现,为什么进展如此之快,为什么治疗无效,于是 Sepich-Poore 决定自己去寻找答案。

他自学了生物信息学和机器学习以探究癌症是如何随时间演化的。后来他开始阅读有关血液诊断的文献,寻找癌症筛查和检测的新策略。2016 年,他进入加州大学圣地亚哥分校医学院学习,渴望了解胰腺癌诊断和治疗的新进展。

不幸的是,他发现,尽管近年来发生了大规模的基因组学革命,但胰腺癌患者的研究并没有取得多大进展。几十年来,这种疾病的五年生存率一直徘徊在 10%或 11%左右。

Sepich-Poore 指出:“这让我想知道,是否可能有一些标记或物质尚未被那些专注于宿主 DNA、RNA 或蛋白质的人所解释。”而这些未被关注的物质却可能有助于更早地发现癌症。然后他看到了 Straussman 在 2017 年发表的文章,该文章显示,细菌不仅存在于肿瘤微环境中,还可能影响癌症对治疗的反应。他回忆说,当时感觉很震惊。

Sepich-Poore 怀疑实际上没有肿瘤是无菌的,而且其中存在的微生物可以提供关键信息。在上医学院之前的夏天,他曾在 Knight 的实验室待过一段时间,于是他回到那里继续攻读博士学位,前六个月他分析了癌症基因组图谱项目(The Cancer Genome Altas)中的一部分全基因组和转录组数据。他的分析涵盖了超过 10000 名患者的组织和血液样本,囊括了 30 种以上的癌症。

Knight 解释说,乍一看,这些数据令人失望,因为研究人员在微生物 DNA 中发现的大多数变异都可以归因于研究的地点。但是当 Sepich-Poore 应用了他在分析人类癌症数据时用来解释批量效应的统计方法后发现“能够消除所有噪音,而且特定样本中的细菌能够给出你患了什么样的肿瘤和处于什么阶段的信号”。

然后,为了去除潜在污染细菌的数据,Sepich-Poore 使用了一系列现有的统计技术。

Sepich-Poore 说:“为了实现这一目的,我们发现超级计算机需要连续运行六个月,这真是令人惊讶。”

“结果显示,没有一种肿瘤是无菌的;我们在每种肿瘤中都发现了微生物 DNA 和 RNA……除此之外,每种肿瘤都有一个独特的微生物组。”从癌症患者身上采集的血液样本也具有基于肿瘤类型的独特微生物特征,这提高了基于癌变组织微生物组进行微创诊断的可能性。

注考虑到这种检测癌症的潜力,Knight、Sepich-Poore 和时任 UCSD 微生物组创新中心执行主任的 Sandrine Miller Montgomery 申请了涵盖该方法的专利,并创建了 Micronoma 公司。

该公司于 2019 年夏天成立,并于 2020 年 8 月正式启动。Micronoma 公司现任首席执行官兼总裁 Miller Montgomery 表示,该公司的第一款产品将专注于肺癌检测,并正在合作开发其它癌症类型的诊断方法。同年 12 月,Sepich-Poore 通过了论文答辩,并正式加入 Micronoma 公司,担任其首席分析官。

其它实验室也发表了可支持微生物用于癌症诊断的研究。例如,去年夏天,有研究人员报告说,与健康对照组相比,他们在黑色素瘤患者的血液中识别出了微生物 DNA 特征。

Knight 说:“我们认为这是一个非常重要的证据。”这尤其令人兴奋,因为黑色素瘤是他们的诊断算法中表现最差的癌症类型,他补充道,“不是说很糟糕,但效果不如其它类型。即使在最糟糕的情况下,别的团队也能独立地看到非常显著的结果,这让我们深受鼓舞。”

微生物特征也可能包含预后信息,或许有助于预测治疗反应。例如,在 Straussman 于 2020 年发表的研究中,数据显示,对免疫治疗有或没有反应的黑色素瘤患者,其肿瘤中的微生物特征是不同的。Straussman 说:“你可以找到富集在应答者或无应答者中的特征细菌。”

不到一年前,MD Anderson 的医生兼科学家 Florencia McAllister 与 Wargo 及其他同事发现,肿瘤微生物组可以用于区分胰腺癌患者在确诊后是否存活了五年以上。

“在寿命较长的患者中,肿瘤微生物的异质性更高。”McAllister 说,他正在根据这项研究申请专利。

现在难以解决的关键问题是细菌和其它微生物对肿瘤的发展、进展和治疗反应有什么影响。Straussman 说:“阐述不同的肿瘤类型中存在这些细菌只是其中一步,我们需要更多地了解这些细菌是如何影响癌症生物学的。”

⑤ 一个广阔的研究领域

没有人真正知道微生物在癌症中起着什么作用,但最近的研究结果表明,这些微生物并非一无是处。

例如,在 S?llberg Chen 对胰腺囊肿的研究中,研究人员怀疑细菌可能会引发炎症,因为他们注意到囊肿液中存在高水平的细胞因子和其它炎症标记物。果不其然,当研究人员将从切除的肿瘤中培养出来的细菌放入体外胰腺细胞中,包括健康细胞系和致癌突变细胞系时,他们发现一些微生物导致了大量的 DNA 损伤,最终导致细胞死亡。

S?llberg Chen 说:“有些细菌实际上并没有做太多坏事,但有些细菌却有点恶毒。隐藏在胰腺内的一些细菌可能是坏的。如果它们长期隐藏在那里,或许会帮助癌症发展。”

研究人员也在探索免疫系统对肿瘤中的细菌的响应。例如,Straussman 及他的同事 Weizmann、Yardena Samuels 与 Wargo 等人合作发现 T 细胞会呈现来源于肿瘤的微生物的肽类。

Straussman 说:“这意味着我们的免疫系统在某种程度上确实看到了这些细菌。”没有参与这项研究的 Ajami 对此表示同意:“我们现在知道,它们不仅存在,而且正在被免疫系统检测和处理。”Knight 补充说,这些结果指出了微生物组影响患者治疗反应的一种潜在机制。

最近的一些回顾性研究表明,服用抗生素与免疫疗法和化疗(如吉西他滨)的响应有关,这进一步支持了微生物组在癌症预后过程中的重要性,并且作用的性质似乎因癌症类型而异。

Straussman 说:“抗生素似乎对胰腺癌患者有益,而对黑色素瘤患者,抗生素似乎具有有害作用。”

事实上,肿瘤微生物组的研究人员敏锐地意识到,细菌并不总是有害的。McAllister 说:“微生物组是有阴阳两面的,它不会一刀切。”

然而,这些研究的一个局限性是,这些影响可能不一定与肿瘤微生物组的变化有关,因为肠道微生物组也会受到抗生素使用的影响。McAllister 说:“独立于肠道微生物组的肿瘤微生物组的作用是一个非常重要的问题,大多数时候,我们调节肿瘤微生物组的同时也在调节肠道。”

事实上,当她和同事从胰腺癌患者身上提取细菌,并将其通过口服的方式给予经抗生素处理的小鼠时,首先也是最重要的是改变了小鼠的肠道菌群组成。其次,研究人员确实也看到了肿瘤微生物组的显著变化,包括在患者肿瘤中富集的细菌增加。

作者在论文中写道:“这些数据表明,肠道微生物组可以调节肿瘤微生物组,其中一小部分是直接转移到肿瘤中,但更显著的是通过改变微生物环境的方式。”结果是明显的:与接受短期存活者移植的小鼠相比,接受长期存活者微生物组移植的小鼠肿瘤生长较慢,这表明细菌具有潜在的保护作用。

去年两个独立的研究小组在同一期Science杂志上发表了研究,探究了粪菌移植是否可以调节人类对癌症治疗的反应。这些试验表明,转移性黑色素瘤患者接受来自对治疗有应答的供体的粪菌移植后,对抑制剂免疫疗法的反应有所改善。

Knight 说,利用粪菌移植将无应答者变成应答者是“一件了不起的事情”。他补充道,虽然在这种情况下,研究集中在控制肠道微生物组,但“改变肠道中的东西,可能会改变肿瘤中的东西”。

研究人员正在寻求的另一种可能性是利用细菌本身作为癌症治疗手段。事实上,科学家们多年来一直致力于设计细菌来寻找和消灭癌症。Straussman 说:“现在,我们对肿瘤中发现的细菌了解得越来越多,也许可以将其作为治疗癌症的一种新方法。”

为了能够充分利用细菌和其它微生物的力量来治疗癌症,研究人员需要更好地理解两者之间的关系。一系列悬而未决的问题层出不穷:肿瘤微生物组有多稳定?它如何与肠道微生物组相互作用?肿瘤中的细菌是如何在独特的微环境中进化的?这只是微生物学方面;还有癌症方面。微生物在克隆进化、转移、治疗反应、免疫环境等方面发挥着什么作用?

Straussman 说:“这是一个简短的清单……所有与肿瘤生物学有关的事情现在都可以重新审视了。”他说他很欣赏这个小但却不断发展的领域的合作精神。“我们有很多的方向可以前进。”

原文链接:

https://www.the-scientist.com/features/could-cancer-s-microbiome-help-diagnose-and-treat-the-disease-69733

作者 | Jef Akst

编译 | 小牟牟