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湖北大学自主研发可编程核酸酶检测法,精准度可达100%

2021 开年第一周,北京、河北、辽宁多地新冠确诊病例增多,疫情似乎有“卷土重来”的意思。但值得庆幸的是,针对疫情的检测环节,我们迎来了一个好消息。

湖北大学省部共建生物催化与酶工程实验室马立新团队自主开发了一套全新的新冠检测技术,通过将可编程核酸酶 PfAGO 与 RT-PCR 技术相结合,实现对新冠病毒核酸的高灵敏、高准确度快速检测,同时该方法可以区分新冠病毒的突变体。实验检测结果表明,通过该方法新冠核酸检测特异性和准确度达到了 100%。

目前,马立新团队所著的研究论文《基于 PfAgo 的新冠病毒核酸检测》已发表于 Biosensors and Bioelectronics。

图 |《基于 PfAgo 的新冠病毒核酸检测》

回忆起研究的初衷,马立新表示,“最初是想做新的基因编辑酶,因为 Crispr 编辑技术都是外国人发明的,专利都是外国人的,所以我们就想从 Argonaute 入手,希望能研究出有自主知识产权的基因编辑方法。在这个过程中,意外发现了 PfAgo 的独特性质。”

2020 年年初疫情肆虐,马立新想到了 PfAgo 可以用作新冠的核酸检测,但因为武汉封城,导致大部分师生都没办法返校,留校的师生也没办法进实验室工作。这让整个团队都很着急。

“我们对自己的实验设计还是很有信心的,希望能尽快将自己的方法建立起来,为新冠疫情做点什么。” 马立新的学生王飞回忆道。“4 月份武汉开始复工后,我们回到停摆了 3 个月的实验室发现,很多材料都坏了,连纯水系统都不能正常工作,我们克服了很多困难才完成了这个方法。”

虽然过程很艰辛,但结果是美好的。通过团队的研磨,自主开发了国内首个基于 PfAGO 的核酸检测法

马立新告诉 DeepTech,PfAgo 可以用切割双链 PCR 产物产生的单链 DNA 作为向导发动下一轮的切割,这是 PfAgo 核酸检测法成立的基础。

PfAgo,一个隐藏在可编程内切酶里的 “福尔摩斯”

2020 年 12 月中旬开始,北京接连几天爆出感染病例,让大家再度紧张起来。根据北京疾控中心公开披露了病源流调显示,一位印度尼西亚籍男子 2020 年 11 月 26 日入境,为 1 例境外输入病例同航班密切接触者;在福建隔离满 14 天,经核酸检测为阴性后,于 12 月 10 日到达北京;12 月 26 日该男子检测新冠病毒核酸阴性,血清 IgM 抗体阳性;12 月 27 日在其居住地及工作地点环境中,检出新冠病毒核酸阳性;12 月 28 日检测新冠病毒核酸为阳性,综合流行病学史、临床表现、实验室检测和影像学检查等结果,当日诊断为无症状感染者。

不难看出,该男子前后至少经历了 4 次以上的核酸检测,但直到最后确诊才明确检测出新冠病毒核酸为阳性。除了受到体内抗体等因素的影响,新冠检测的精准度问题再次引发公众关注。

作为抗击新冠病毒的重要环节,核酸检测结果是判断被检测者感染与否的基础标准。但在核酸检测的环节中,“假阳性” 和 “假阴性” 的问题一直存在。

核酸检测的 “假阳性” 指被检测者本来没有感染新冠病毒,但核酸检测结果呈阳性。“假阴性” 则相反,指被检测者通过临床症状、肺部影像、流调史等方面都支持为新冠确诊病例,但核酸检测结果为阴性。

马立新介绍,造成 “假阳性” 或 “假阴性” 的原因各不相同。通常 “假阳性” 是由于人为操作不当或者样品交叉污染所致;而导致 “假阴性” 的原因则复杂很多,包括病毒潜伏周期长短、不同部位病毒载量差异、采样环境不达标等等,这也是导致国内疫情早期核酸检测 “假阴性” 多的原因。

目前,新冠核酸检测的 “金标” 还是利用 TaqMan 探针法的荧光定量 PCR 技术,如果样品中存在靶 DNA,随着 PCR 的进行荧光探针会被降解,淬灭基团和荧光基团分离,从而产生荧光。但这种方式的弊端是在进行大规模筛查时需要大批量昂贵的荧光定量 PCR 仪以及训练有素的专业检测人员,并且容易造成假阳性 / 假阴性。

寻求理想的核酸检测方法很有必要。

马立新团队采用了基于 PfAgo 的新冠核酸检测方法:首先通过 RT-PCR 技术对待检样本进行扩增,然后向 PCR 产物中加入 PfAgo/guide DNA 复合物以及对应的分子探针,95℃环境(PCR 或金属浴加热器)反应 20-30 min 后用荧光定量 PCR 仪或者其它的荧光读取设备来进行荧光分析,该方法将荧光定量 PCR 仪的利用率提高了 20 倍左右。

图 | 基于 PfAgo 的新冠病毒核酸检测方法(SARS-CoV-2 PAND)示意图

该方法能够同时检测新冠病毒的 N 基因和 ORF1ab 基因,同时以人的核酸酶 P 基因(Human RNase P)作为参比保证结果的可靠性。

马立新介绍,PfAgo 是一种原核生物的 Argonaute 蛋白,作为可编程的核酸内切酶,PfAgo 有以下 3 个特点:

1)没有 PAM 的限制,不需要特定的识别序列;

2)可用短的 DNA 作为向导引导 PfAgo 去靶向切割单链或者双链 DNA;

3)具有单碱基专一性,向导 DNA 与靶 DNA 一个碱基的不匹配都会影响 PfAgo 的酶切活性。

“PfAgo 在检测环节中扮演了一个类似侦探的角色,顺着 DNA 的引导线索来破案。” 马立新补充道。

与 PfAgo 类似的还有 Cas 蛋白。此前 2020 年诺贝尔化学奖获得者 Jennifer Doudna 和美国麻省理工学院(MIT)终身教授张锋就分别发展了基于 Cas 蛋白的病毒核酸检测技术,包括 DETECTR、SHERLOCK 等。

pfAgo 核酸检测法灵敏度最高提升 100 倍,精准度可达 100%

为了实现更灵敏的检测,团队首先通过 RT-PCR 将待测样本中病毒核酸的特定靶序列进行扩增,这一步灵敏度已经可以达到单分子水平了。也就是说,只要有 1 个拷贝的模板就可以进行扩增反应。

随后,向扩增产物中加入 pfAgo 和向导 DNA,切割 PCR 产物后产生新的向导 DNA,再介导 pfAgo 去切割分子信标。由于一个分子的 pfAgo 可以切割多个分子的靶 DNA,相当于一个级联放大的过程,因此灵敏度可以在 PCR 的基础上再提高 50-100 倍。

图 | PfAgoRT-PCR 检测法与 q-RT-PCR 检测灵敏度的对比

在准确性方面,团队优化了 PCR 扩增的引物,加上没有 TaqMan 探针的干扰,使得 RT-PCR 具有很高的扩增专一性;其次只有特异性扩增产物才会被 PfAgo 特异性切割,两个因素加在一起,确保了检测的准确性。

团队与湖北省疾控中心合作对 36 个新冠核酸检测为阳性和 8 个新冠核酸检测为阴性的咽拭子提取物进行检测,检测结果表明该方法的特异性和准确度达 100%,且所有阳性样本均被鉴定为是未发生突变的野生型。

图 | 利用 PfAgo 新冠病毒核酸检测方法对 44 个咽拭子样本进行检测

此外,团队还对市场上不同的 RT-PCR 试剂进行了对比,研究结果表明不论是进口还是国产的 RT-PCR 试剂都能很好地与 PfAgo 新冠病毒核酸检测方法兼容。

值得注意得是,此外,PfAgo 新冠核酸检测法还能够准确地鉴定新冠病毒突变体。

马立新解释称,pfAgo 是在向导 DNA 介导下专一性切割靶 DNA 的,向导 DNA 跟靶 DNA 在序列上哪怕存在一个碱基的差异都会导致 pfAgo 无法切割靶 DNA。

团队利用 pfAgo 的这一特质,在突变位点筛选出一条能够有效切割野生型靶 DNA,但是不能切割突变体的向导 DNA,同时筛选出一条能够有效的对突变体进行切割、但不能切割野生型靶 DNA 的向导 DNA,分别将这两条向导 DNA 加入到检测体系中,然后比较荧光读值的差异,就可以知道相应病毒的基因型了。

图 | 马立新团队在实验中(右一为马立新)

不仅如此,对于 DNA 病毒,pfAgo 核酸检测法可以直接以基因组 DNA 为模板进行扩增,然后进行检;对于 RNA 病毒,通过 RT-PCR 把 RNA 转换成 DNA 进行检测。这意味着,基于 PfAgo 的新冠病毒检测系统在控制由病毒引发的大规模传染病流行方面具有巨大的潜力。

马立新透露,目前 pfAgo 核酸检测技术在实验室阶段经过反复验证已经十分成熟了,并且也有多家公司在跟团队接触,我们希望能够早日将该检测方法推向市场,成为对抗疫情的一个重要工具。

关于未来,马立新希望能够继续深入可编程核酸酶的发掘及应用,同时在利用可编程核酸酶开发新的核酸检测技术上不断创新,致力于打破国外技术垄断,开发具有自主知识产权的检测方法。