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环境监测假阳性,为什么难以杜绝?

完全清除环境假阳性的代价高于多轮监测。

撰文 | 李庆超(山东师范大学)

8月25日,北京中国科学院大学奥运村校区校园内环境监测样本中发现一处点位为新冠病毒阳性,临时封闭,全员核酸检测后,未发现人员阳性。不久,校园重新开放。幸好,这只是一场虚惊。

这种在环境样本监测中发现阳性样本,但最后判定并非“真污染”的情况,类似于核酸检测实验室中发生的假阳性现象。当前,“人物同防”已成为我国疫情防控的重点,环境新冠核酸监测是常态化防控中不可或缺的环节。但是,环境监测屡屡出现“假阳性”,给疫情防控带来了困扰。

环境中的核酸污染来源很多。今天,我们主要讲讲病毒基因扩增(如在核酸检测中)等操作可能带来的污染应怎样防控。同时,也要问问,完全清除环境监测中的假阳性,是否能做到?我们要先从核酸检测的原理讲起。

1 病原体检测

病原特异性检测是最直接和有效的传染病诊断方法。它可以给出特定病原体存在或不存在的证据,一般来说有三种检测思路:

①直接观测:直接观测病原体本体的存在。例如用染色或培养观察的方式来检测细菌,用电镜观察病毒。这种方法常用于诊断感染或发现新病毒。

②组分检测:并不直接检测病原体本身,而是检测病原体所含的特异性物质,来判断其是否存在。比如,检测到新冠病毒的部分特异性核酸序列,就能证明人体内存在新冠病毒。现在我们做的核酸检测,就是采用组份检测的思路。

③感染后果检测:通过检测病原体感染宿主造成的特异性后果来间接检测病原体的存在,例如某些特征性的损伤或病理反应,及免疫反应产生的特异性抗体引发的血清学现象等等。临床中常用的方法是检测病原体的特异性抗体。这种方法操作简单、无需特殊仪器,但是存在窗口期,仅能证明某人接触过病原体抗原(可能是自然感染、也可能是疫苗注射)并产生了抗体,但不能知道体内是否有病原体。

2 核酸检测

核酸检测的本质是特异性引物指导下的特异性序列扩增和检测,具有极高的灵敏性。它的原理是:1)设计使用特异性的核酸探针,2)该探针可以根据碱基互补配对原则来结合特异性的病毒序列,3)并在聚合酶的帮助下进行DNA延伸扩增,4)在荧光物质的帮助下,5)通过检测DNA扩增的结果来判断是否存在特异性的病毒序列,从而证明是否存在病毒。其中非常重要的因素是特异性引物和模板。

世间生灵百态,都使用核酸(主要为DNA,RNA病毒为RNA)作为遗传物质。遗传信息就储藏在长长的核酸分子的碱基(DNA为A、T、C、G;RNA为A、U、C、G)的排序中。而你、我的差异,你我与病毒的差异都写在这些由碱基序列组成的遗传信息中。病毒遗传信息,也就是核酸碱基序列(模板)的存在,就可证明病毒的存在。

探针或引物是一段短的(长度通常在20个碱基左右)单链脱氧核糖核酸。可以根据碱基互补配对原则( C≡G、A=T或 A=U),与其它核酸链进行配对。引物或探针的设计是检测特异性病毒序列的关键,要在待检测病毒独有的序列上进行设计。我们以20个碱基特定序列为例,随机产生此序列大概需要4^20次方的随机DNA序列(数据容量为1TB,而人类基因组信息约为3GB),再加上一对引物、并考虑扩增长度的限制,基本能够达到特异性检测的目的。与模板互补配对后,引物在DNA聚合酶的帮助下来合成DNA。而合成后的DNA又可以作为模板供下一轮引物结合,和DNA合成,如此一来,特定的DNA片段可以指数级的扩增,新产生的DNA链可在有限的循环内(一般为35-40)达到很高的量,足以被检测。这种神奇的技术就是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),而能够实时监测扩增量的PCR称为荧光定量PCR(qPCR),后者是实验室最常用的病毒核酸检测方法。

图1. PCR的基本原理。红色的为引物,绿色的为核苷酸及新生链,蓝色的为模板链。引物以碱基配对的方式特异性识别模板,并在聚合酶(黑色)的帮助下进行延伸,经过数次变性(拆开模板DNA双链)、退火(引物与模板DNA单链结合)、延伸(酶催化产生新生链)的热循环,特定DNA片段成指数增加。(点开看大图)

3 怎样预防假阴性和假阳性?

检测实验的关键有两个,一个是灵敏性、一个是特异性。通俗的说,灵敏性是指样品里“有”(阳性),检测结果证明为“有”(阳性)的能力;而特异性,是指样品里“没有”(阴性),检测结果证明为“无”的(阴性)能力。

检测实验害怕的结果也有两个,一个是假阳性,一个是假阴性。假阳性是指,本来没有,检测说是有;假阴性是指本来有,检测说没有。

一把宝剑,最锋利处,恰是其最脆弱之处。PCR技术具有极高的灵敏性,同时也导致其极易产生假阳性。PCR或qPCR检测的假阳性往往是由以往的PCR扩增产生的产物污染后续试验样本或检测体系造成的,因为PCR扩增产物是同一对引物完美的模板。这是核酸检测实验室需要千方百计避免的恶梦。

1.合理的实验室设计

根据卫生部 2010 年颁布的《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》,一个合格的临床基因扩增检验实验室需要设置四个隔开的工作区域:

试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、分装和扩增反应混合液的配制(最好在超净工作台中进行)

标本制备区:核酸(RNA、DNA)提取(视样品情况可在生物安全柜中操作)、 贮存及其加入至扩增反应管;

扩增区:DNA 和 cDNA 的扩增及检测(定量 PCR 分析), 巢式 PCR 测定的第二次加样必须在扩增区进行

扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定(全自动核酸扩增 仪,如定量 PCR 仪时,产物分析区可以和扩增区合并)

进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,通过传递窗传递样品,气流方向也要按照单一流向,要从洁净区到污染区,可按照上述隔间顺序空气压力递减的方式进行,防止扩增产物随气流进入上游区域。其中标本制备区可设立正压条件(制备区气压高于其他地区,外部空气无法流入正压区),避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。

扩增区和扩增产物分析区是产生 PCR 产物气溶胶的主要区域,所以可设立负压条件(指该区气压低于外部,区域内的空气无法流到外面),避免气溶胶外泄。基因扩增实验室通常用实验室的相对正压或负压来控制气流,如安装排风扇、负压排风装置、空调通风系统等,最好采用全送全排方式,条件和空间允许的话,每个区域可设定缓冲区。

图2. 实验室设计示意图。来源https://tools.eppendorf.cn/virus/notice.html

2.严格的实验操作和管理

要做到准确检测,光有合格的检测实验室还不够,还需要严格培训操作人员。人为因素(错误操作等)和操作人员本身(头发、皮屑等)的因素,在样品制备、 PCR 扩增和 PCR 前 / 后的实验操作中,都可能会引起气溶胶污染。不规范的操作,可在移液器使用过程中、在PCR 仪使用中,或在 PCR 产物分析过程中引起污染。

图3. 罗氏公司出品的自动核酸提取和检测仪器。目前医院、检测机构或壕实验室可配置这种全自动核酸提取、逆转录和检测仪器。

进入实验室的人员需受到严格的管控,进入前需进行严格的培训。同时要特别留意非实验室人员的进入和行为对实验室的影响,例如清洁人员、仪器安装和维修人员、物业人员等。这些人员不在培训之列,但很难避免其进入,在实验室维护和污染排查中应给予足够的重视。

图:八联管。这个小管子是常用的逆转录或PCR管,盖子一开,很容易弹出液滴来。

3.严谨的对照实验

设置严谨的对照有利于监控试剂和环境,排查污染,避免重大的检测结果偏差事故。主要的实验对照有三种:

阳性对照:正常实验条件下,阳性对照一定可以出现阳性结果。如果阳性对照出现阴性结果,表明本次实验体系存在问题,那么本次实验中其他阴性结果是否为真是存疑的。因此,阳性对照一般用于监测试剂质量、仪器运行,是实验体系一切正常的指标。

空白对照:是指用水代替模板 DNA 进行 PCR 反应,每次实验都要进行空白对照。它能帮助我们确定 PCR 反应中所使用的溶液和试剂是否存在污染,帮助我们排除假阳性结果。如果空白对照出现阳性结果,则表示反应过程中存在交叉污染或者实验室空气存在污染。需结合环境对照结果,判断污染源,如环境对照呈现阴性结果,就要尽快更换使用的溶液和试剂。

环境对照:又称开管对照,用于确定实验空气中是否存在气溶胶污染。在试剂准备、样品制备、核酸制备和 PCR 扩增准备四个阶段中,均需设置环境对照。该对照是在管中加入不含核酸的适量体积的水,在样品测试整个过程中均敞开与空气接触,与样品同时进行PCR反应。如果结果显示阳性,那么提示某个房间或者分区已经出现气溶胶污染。

4.细致地清除污染

在核酸检测的过程中,即使完全按照规范操作,也无法避免样品滴溅、扩散到操作台等其他地方,因此,必须要日常消杀和清除DNA,避免污染。清除污染的工作主要包括:

消毒杀菌:每个实验室都要进行。包括紫外线照射、异丙醇或酒精喷洒擦拭及高温高压灭菌等方式。

降解DNA:用于实验室DNA模板的降解。例如紫外线照射可以减少长片段DNA的污染,而用次氯酸钠(5-10%)、 甘氨酸-盐酸缓冲液、盐酸(1mol/L)清洁台面、操作工具、样品架、塑料及玻璃器皿,可以消除大部分DNA污染。

使用UNG-热启动Taq酶系统:该系统的工作原理是用脱氧尿苷三磷酸(dUTP)代替脱氧胸腺三磷酸(dTTP),从而产生dUTP标记的PCR产物。这一产物会在下一次PCR反应进行之前被尿嘧啶DNA-糖苷酶(UNG)降解,确保PCR扩增的全部是天然DNA,而不是含有dUTP的扩增模板DNA。

4 百密一疏的大环境污染

防治核酸检测的各种污染,总体上来说是一个局限于检测实验室内的问题。但也有不少专家撰文认为,大环境污染也会给核酸检测和病毒筛查带来假阳性。

所谓大环境污染,是指发生于实验室外的环境或人群之中的核酸污染。例如,各类分析显示,疫苗的使用可能会让非感染人群接触到病毒序列,从而在检测过程中被检测为阳性。灭活病毒疫苗、mRNA疫苗、病毒载体疫苗等含有病毒序列的疫苗中,都可以引发这类核酸污染;亚单位疫苗中残存的核酸序列,也可能导致污染。

此种顾虑不无道理,但是治理和收益严重不匹配,笔者建议公众不必放在心上。从治理上来说,疫苗生产很难做到100%清除病毒序列。而人体中存在大量的核酸酶,对外源物质具有很高的动态清理能力,即便疫苗中含有病毒序列,注射进入人体后也会被很快降解。万一,万一就是那么倒霉,注射疫苗后短时间内去做核酸检测,被报告为阳性,也可以通过二次检测确认为阴性,排除感染嫌疑。

要说硬要去预防上述情况,可以考虑在PCR检测引物设计时,将检测位置设计在mRNA疫苗、腺病毒疫苗或亚单位疫苗中不存在的非结构蛋白编码基因上,这样可以规避上述疫苗中残存的序列对病毒检测造成的感染。这种方案不适合灭活病毒疫苗,因为灭活苗含有整个基因组。当然,也不是没有办法,理论上可以采用疫苗毒株与野毒差异的序列进行检测。还是那句话,实在没必要……(要说灭活病毒疫苗灭活不完全,或者弱毒疫苗返强造成的感染的检测,这种极端的例子,交给专家,检测公司干不了这个活儿)。

安啦,大家散了吧。

等等,忘了说:医疗垃圾或实验室垃圾需要特殊专业公司处理(按斤收钱帮你倒垃圾),如果相关机构违规处理,就有可能导致病原体泄露。那可是大大的坏,那就关门不要在业界混了。